产品目录

本试剂盒用于对血浆、血清、尿液、动植物组织或细胞裂解液中MDA进行定量检测，广泛用于脂质氧化(lipid peroxidation)水平检测，特别适用于微量脂质氧化检测。

本试剂盒采用一种基于MDA和硫代巴比妥酸(TBA)反应产生红色产物的显色反应，随后通过荧光比色法对样品中MDA进行检测。丙二醛在较高温度及酸性环境中可与TBA发生反应，形成红色的MDA-TBA加合物，MDA-TBA加合物在553nm处有最大吸收，以515nm为激发光，据此可以通过荧光比色法进行检测。

动物或植物细胞发生氧化应激(oxidative stress)时，会发生脂质氧化。丙二醛(MDA)是一种生物体脂质氧化的天然产物，一些脂肪酸氧化后逐渐分解为一系列包括MDA在内的复杂化合物，此时通过检测MDA的水平即可检测脂质氧化的水平，因此MDA的测定被广泛用作脂质氧化的指标。生物体内的一些其它生化反应也会产生MDA，例如thromboxane synthase也可以催化产生，但只要在测定时设置适当对照即可观察到脂质氧化水平的变化。

• 蒸馏水
  
• 离心管、小试管或96孔板、荧光分光光度计或荧光酶标仪、离心机、水浴锅或恒温箱

• 上述低温试剂避免反复冻融，以免失效或效率下降。
  
• 参考取样量：血清、血浆、尿液取20μL；低密度脂蛋白悬液取20～40μL；食用油取30μL；肝脏、心肌、肌肉等，取5%或10%匀浆20～40μL。
  
• 待测样本如不能及时测定，应置于-20℃保存，4天内稳定。
  
• 避免使用EDTA、枸橼酸、氟化钠、草酸等抗凝剂。
  
• 稀释后的MDA标准品4℃避光保存，3个月内有效。
  
• TBA工作液应4℃避光保存，1个月有效。
  
• MDA测定步骤中，离心分层抽取上层时，若出现浑浊，可加1滴无水乙醇。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
  
• 试剂开封后请尽快使用，以防影响后续实验效果。

• 样本处理：
  
  • 血清、血浆、尿液、脑脊液样本：从待测样本中分离出的血清或血浆不应有溶血。取20μL待测液体样本，依次加入0.5mL MDA沉淀液、3.5mL蒸馏水和0.5mL磷钨酸溶液，摇匀，室温静置5分钟，3500r/min离心10分钟，弃上清。沉淀加入1mL蒸馏水，振荡混匀2分钟，以便充分溶解沉淀(MDA样品)，即获得MDA待测液。
    
  • 组织、细胞等样本：组织或细胞可以使用PBS或Western及IP细胞裂解液等进行匀浆或裂解。匀浆或裂解组织时，组织重量占匀浆液或裂解液的比例应为10%；
    对于细胞，每10⁶个细胞使用0.1mL裂解液或匀浆液。匀浆或裂解后，1600r/min离心10min，取上清用于后续测定。匀浆或裂解等样品制备步骤宜在冰浴或4℃进行操作。样品准备完毕后可以用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的MDA含量。取20μL待测匀浆后提取的上清，依次加入0.5mL MDA沉淀液、3.5mL蒸馏水和0.5mL磷钨酸溶液，摇匀，室温静置5min，3500r/min离心10min，弃上清。沉淀加入1mL蒸馏水，振荡混匀2min，以便充分溶解沉淀(MDA样品)，即获得MDA待测液。
    
  • 本试剂盒对于样品中的常见化学成分的兼容性参考下表：
    

    试剂类别	化学成分	是否干扰
    缓冲液	HEPES (100mM)	否
    	Borate (50mM)	否
    	Phosphate (100mM)	否
    	Tris (25mM)	否
    去垢剂	CHAPS (≤1%)	否
    	Triton X-100 (≤1%)	否
    	Tween 20 (≤1%)	否
    抑制剂/螯合剂	PMSF (≤200μM)	否
    	EDTA (≤1mM)	否
    	EGTA (≤1mM)	否
    	Antipain (≤100μg/mL)	否
    	Chymostatin (≤10μg/mL)	否
    	Leupeptin (≤10μg/mL)	否
    	Trypsin (≤10μg/mL)	否
    其他	Glycerol (≤10%)	否
    	Sucrose (250mM)	是

• 稀释标准品：取适量MDA标准品(1mmol/L)用蒸馏水稀释至0.5、1、2、5、10μM(如果进行简易快速检测，标准品直接稀释至0.5μM)。
  
• 配制TBA工作液：称取适量TBA，用TBA稀释液配制成浓度为0.68％的TBA工作液。例如取34mg TBA用5mL TBA稀释液配制，最终浓度即为0.68%的TBA工作液。TBA工作液需完全溶解后再使用，可以加热到60℃促溶，并可通过反复剧烈Vortex促溶。
  
• MDA加样：在离心管或其它适当容器内参考下表设置检测反应体系，依次加入试剂：
  

  成分	空白管	标准管	测定管
  蒸馏水	1mL	－	－
  MDA标准品	－	1mL	－
  MDA待测液	－	－	1mL
  TBA工作液	1mL
  抗氧化剂	30μL

  混匀，加盖，95℃准确水浴煮沸60min(勿动)，加热时务必注意避免液体暴沸溅出。如果使用加热块(Heat block)进行加热注意用重物压紧离心管盖；如果使用沸水浴，则需使用可把盖子锁死的离心管或螺旋盖离心管，或用Parafilm封住离心管口，用针头刺一小孔。最方便和准确的加热方法是使用带有热盖并可以加热的金属浴仪器。
  
• MDA测定：水浴或流水冷却至室温，加入MDA分离液3.5mL，振摇并抽提1min，3000r/min离心5min，取上清，蒸馏水调零，用荧光光度计或荧光酶标仪检测荧光强度，激发光515nm，发射光553nm。

对于血浆、血清或尿液等样品，以MDA标准品浓度为横坐标，以对应的荧光强度为纵坐标，制作标准曲线，根据标准曲线计算处MDA提取液的浓度；

如果进行简易快速检测，直接乘以0.5μM标准品进行计算获得MDA的摩尔浓度，对于细胞、或组织样品，计算出样品溶液中的MDA含量后，可以通过单位重量的蛋白含量或组织重量等来表示最初样品中的MDA含量，例如μmol/mg蛋白或μmol/mg组织。

• 简易快速血清、血浆、尿液等液体样品中MDA含量计算公式：
  MDA浓度(μmol/L)=(A _测定-A _空白)/(A _标准-A _空白)×25
  
• 简易快速细胞、组织样品中MDA含量计算公式：
  MDA浓度(μmol/mg)=(A _测定-A _空白)/(A _标准-A _空白)×25/蛋白质浓度(mg/ml)